40s核糖体蛋白亚基3处理的自分化树突状细胞增强了间皮素特异性T细胞对三阴性乳腺癌的细胞毒性

三阴性乳腺癌 (TNBC) 缺乏靶向治疗，预后不佳。利用间皮素 (MSLN) 特异性 T 细胞靶向治疗过表达的间皮素 (MSLN) 是一种颇具前景的治疗方法，也是本研究的目的。本研究通过免疫组化技术分析了人 TNBC 石蜡切片中 MSLN 的表达。构建了携带粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、白细胞介素 4 (IL-4) 和 MSLN cDNA 的慢病毒载体，以生成可与表达肿瘤的 MSLN 树突状细胞 (MSLN-SmartDC) 反应的自分化髓系衍生抗原呈递细胞，从而激活 MSLN 特异性 T 细胞。结果显示，在所有乳腺癌亚型中，32.8% 的 MSLN 表达较高，在 TNBC 中，这一比例为 57%。高MSLN与TNBC亚型以及雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2的缺失显著相关。MSLN-SmartDC表现出与外源性细胞因子治疗产生的DC相似的表型，并添加了40s核糖体蛋白亚基3 (RPS3)，这是一种Toll样受体4的配体，通过上调CD40、CD80和CD83的表达以及IL-12p70的分泌，增强了DC的成熟和功能。在MSLN-SmartDC和RPS3-MSLN-SmartDC激活的T细胞中均检测到MSLN特异性CD8 ⁺ CD69 ⁺ IFN-γ ⁺ T细胞。在二维 (2D) 和三维 (3D) 培养体系中，这些树突状细胞 (DC) 激活的 MSLN 特异性 T 细胞均表现出比亲本 MDA-MB-231 更高的针对自然表达的 MSLN-HCC70 和人工过表达的 MSLN-MDA-MB-231 的杀伤能力。总而言之，结果证明了 MSLN-SmartDC 能够促进 MSLN 特异性 T 细胞对 TNBC 的应答，并且 RPS3 可以增强这些 T 细胞的细胞溶解活性，为 TNBC 患者提供了一种替代治疗方法。

三阴性乳腺癌 (TNBC) 是乳腺癌的一种亚型，占所有乳腺癌的 15% 至 20%，其特征是缺乏雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR) 和人表皮生长因子受体 2 (HER2) ( 1 )。TNBC 在年轻患者中占比较高，临床特征侵袭性强，预后较差 ( 1 )。由于缺乏激素受体和 HER2 表达，TNBC 对激素和 HER2 靶向治疗的敏感性较低 ( 1 )。目前，TNBC 的标准治疗是手术切除和化疗 ( 1 )。尽管一些研究表明 TNBC 对化疗的敏感性高于其他亚型，但部分患者在治疗后 5 年内会出现内脏器官复发 ( 1,2 ) 。许多生物标志物已被确定为乳腺癌的诊疗生物标志物，例如微小RNA、检查点分子、表观遗传谱和异常信号分子，但这些标志物在三阴性乳腺癌（TNBC）患者管理中的有效应用有限（3-5 ）。因此，开发一种新的治疗方法来改善三阴性乳腺癌患者的治疗效果至关重要。

基于树突状细胞 (DC) 的免疫治疗旨在通过呈递抗原的 DC 诱导抗原特异性免疫反应，从而刺激返回患者的癌症特异性 T 细胞来消除癌细胞 ( 6 , 7 )。我们小组之前已经证明，通过慢病毒转导粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、白细胞介素 4 (IL-4) 和蛋白激酶 cAMP 依赖性 I-alpha 型调节亚基 (PRKAR1A) 产生的单核细胞衍生的 DC 能够有效诱导针对胆管癌细胞的 PRKAR1A 特异性 T 细胞 ( 8 )。这些 DC 被称为自我分化的髓系来源的抗肿瘤抗原呈递细胞 (SmartDC)，并且可以以自分泌方式产生 DC 分化所需的细胞因子以及肿瘤相关抗原加工以激活细胞毒性 T 细胞 ( 8 )。 SmartDC 平台已被证明是一种有效的抗原特异性 T 细胞，可用于治疗白血病、黑色素瘤和胆管癌（8-12 ）。

间皮素 (MSLN) 是一种糖磷脂酰肌醇连接糖蛋白，在间皮细胞中表达有限，但据报道在多种类型的癌症中异常表达，例如卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤和三阴乳腺癌 (TNBC ) ( 13-16 ) 。值得注意的是，它已被认为是癌症免疫治疗的潜在靶点 ( 15-17 )。在乳腺癌中，一些研究报道了 MSLN 在 TNBC 中过度表达，并且其高表达与不良预后相关 ( 14,18-22 ) 。MSLN在TNBC 中过度表达但在正常组织中表达有限，凸显了MSLN 作为 T 细胞治疗靶点的潜力。

树突状细胞激活的 T 细胞的功效在很大程度上受到树突状细胞成熟状态的影响，包括人类白细胞抗原 (HLA)、共刺激分子和细胞因子的表达 ( 6 )。在稳定状态下，树突状细胞有限地表达这些分子，但当遇到来自病原体或癌细胞的因子时，树突状细胞可通过模式识别受体信号通路被激活，例如 Toll 样受体 (TLR) ( 23 ) 。TLR 配体被用作佐剂来诱导多种癌症的免疫反应 ( 23-25 )。一种名为 40s 核糖体蛋白亚基 3 (RPS3) 的 TLR4 配体可以诱导树突状细胞成熟 ( 26 )。总之，本研究旨在调查乳腺癌组织中 MSLN 的表达以及基因操作的 MSLN-SmartDC 诱导针对 TNBC 细胞的 MSLN 特异性 T 细胞应答的潜力。此外，还报道了RPS3治疗对MSLN-SmartDC免疫表型和T细胞活性的影响，从而增强了T细胞的溶细胞活性。这些发现表明MSLN作为潜在的TNBC抗原的作用，并且由RPS3-MSLN-SmartDC产生的MSLN特异性T细胞具有有效的杀伤MSLN阳性TNBC细胞的能力。

酶联免疫吸附斑点试验（ELISpot）

使用人 IFN-γ ELISpot BASIC试剂盒（Mabtech AB）进行IFN-γ ELISpot 检测。简而言之，将 15 µg/ml IFN-γ 捕获抗体在 4°C 下包被过夜。然后用 1×10 4 个MSLN 肽脉冲处理的 HLA-A2 + T2 细胞重新刺激2×10 5 个活化的 T 细胞。用 20 ng/ml 佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯和 1 µg/ml 离子霉素（MilliporeSigma）处理的 T 细胞作为阳性对照。移除这些 T 细胞后，将 1 µg/ml 生物素化的 IFN-γ 抗体在室温下孵育 2 小时，并用 ALP 偶联的链霉亲和素在室温下孵育 1 小时。 IFN-γ 斑点采用 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四唑加底物 (Mabtech AB) 进行评估，并使用ELISpot酶标仪 (BIOREADER®5000Fγ, BIOSyS) 进行捕获。