荧光酶联免疫斑点分析仪（通常指荧光ELISPOT阅读仪）在HEK293细胞感染检测中的应用。

虽然HEK293细胞最常用于蛋白生产或病毒包装，而不是免疫研究，但荧光ELISPOT技术经过适配后，可以成为一个非常强大的工具来检测和量化被感染的HEK293细胞是否

成功表达并分泌了目的蛋白。

这是一种超高灵敏度的功能性检测方法，特别适用于检测分泌型蛋白（如细胞因子、抗体、病毒抗原等）。

基本原理

传统的ELISPOT用于检测分泌细胞因子的单个免疫细胞。其核心原理是：在细胞培养过程中，细胞分泌的蛋白会被板孔底部包被的特异性抗体所捕获。细胞移除后，

被捕获的蛋白通过生物素标记的检测抗体和酶标链霉亲和素进行放大和显色，最终在每个蛋白分泌细胞的原始位置形成一个斑点（Spot）。

荧光ELISPOT则将显色底物（如BCIP/NBT）替换为荧光底物。当酶（如HRP或AP）催化荧光底物时，会产生不溶性的荧光沉淀，从而形成荧光斑点。荧光ELISPOT分析仪

就是一种专门用于自动识别、计数并分析这些荧光斑点的精密成像系统。

在HEK293感染检测中的应用场景

假设您的实验是：使用慢病毒或腺病毒感染HEK293细胞，使其表达并分泌一种特定的目标蛋白（例如，新冠病毒的S蛋白RBD域、一种治疗性抗体轻链或重链、或其他分泌型蛋白）。

您可以使用荧光ELISPOT来：

定量评估感染效率：通过计数斑点数量，推算成功感染并分泌目的蛋白的细胞数量。

评估单个细胞的蛋白分泌能力：通过分析斑点的大小和荧光强度，评估单个细胞分泌蛋白的强弱。

优化感染条件：比较不同MOI（感染复数）、不同感染时间下的分泌细胞数量和质量，找到最佳感染方案。

进行克隆筛选：如果目的是获得稳定高表达的单克隆细胞株，这是一个极好的筛选方法。

实验步骤概要（以检测分泌型目的蛋白为例）

重要前提：您的病毒载体必须携带能促使目标蛋白分泌到细胞外的信号肽序列。

包被抗体：

在ELISPOT板（通常是PVDF膜板）的孔中，包被能够捕获您目的蛋白的特异性单克隆抗体（抗目的蛋白的抗体）。4°C过夜或37°C孵育2小时。

封闭：

弃去包被液，用含血清的细胞培养液（如10% FBS的DMEM）封闭板孔，防止非特异性结合。37°C孵育1-2小时。

接种并感染细胞：

方案A（直接感染）：将不同数量的HEK293细胞（例如，从1x10³ 到 1x10⁵ 细胞/孔）与不同稀释度的病毒液直接在已包被的ELISPOT板孔中共孵育。

模拟病毒感染的真实分泌情况。

方案B（预感染后接种）：先在培养瓶或板中感染HEK293细胞，培养24-72小时后，收集细胞，计数，再将一系列稀释度的细胞接种到ELISPOT板孔中。

此方案可以更精确地控制接种的细胞数。

关键：必须设置未感染细胞的阴性对照和空载体病毒的对照。

刺激与孵育：

将板置于37°C，5% CO₂培养箱中孵育12-48小时。在此期间，被感染的细胞会分泌目的蛋白，并被膜上的捕获抗体立即捕获。

移除细胞和洗涤：

孵育结束后，弃去细胞，用洗板液（如PBS with Tween-20）剧烈洗涤多次，彻底去除所有细胞。

加入检测抗体：

加入生物素标记的、针对目的蛋白另一表位的检测抗体。37°C孵育1-2小时。

加入酶标链霉亲和素：

洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的链霉亲和素。37°C孵育1小时。

加入荧光底物：

对于HRP：使用Tyramide Signal Amplification (TSA) 荧光底物（如FITC-TSA, Cy3-TSA），其灵敏度极高。

对于AP：使用例如Vector® Red或ELF® 97的荧光底物。

孵育后，荧光底物会在酶的作用下形成不溶性荧光沉淀，在曾经有分泌细胞的位点形成斑点。

图像采集与分析：

待板孔完全干燥后，使用Eazyreader荧光ELISPOT分析仪进行扫描分析。

分析仪会自动：

对每个孔进行高清荧光成像。

识别并计数所有荧光斑点。

分析每个斑点的大小（Size）和荧光强度（Integrated Intensity）。

生成数据报告。

数据分析与解读

斑点数量 (Spot Count)：代表在孵育期间成功分泌了目的蛋白的细胞数量。可以直接反映感染效率。

例如：接种了10,000个细胞，检测到500个斑点，意味着大约5%的细胞被成功感染并分泌蛋白。

斑点大小/强度 (Spot Size/Intensity)：代表单个细胞的蛋白分泌能力。斑点越大、荧光越强，说明该细胞表达和分泌的目的蛋白量越高。

结果呈现：

斑点数/每孔或斑点数/每百万细胞（SFU, Spot Forming Units）。

可以绘制曲线，比较不同MOI或不同时间点下的分泌细胞频率。

将荧光ELISPOT分析技术应用于HEK293细胞感染检测，是一种非常前沿且强大的功能学检测方法，特别适用于需要量化分泌蛋白表达细胞数量的高级应用场景。

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