如何使用ELISpot（酶联免疫斑点法）技术在PBMC（外周血单核细胞）中进行抗原特异性T细胞的筛选实验。

ELISpot是检测和量化能分泌特定细胞因子（如IFN-γ, IL-2, IL-4等）的免疫细胞（尤其是T细胞）的极其灵敏的技术。在PBMC中使用ELISpot，主要用于评估针对特定抗原

（如病毒抗原、肿瘤抗原、疫苗候选抗原）的T细胞免疫反应。

实验原理

ELISpot的原理类似于夹心法ELISA，但是在固相板（PVDF膜或硝酸纤维素膜）上进行。其基本过程是：

1. 包被抗体：在96孔板底部包被能捕获目标细胞因子的特异性抗体。

2. 细胞刺激与孵育：加入PBMC和刺激物（抗原），在37°C CO₂培养箱中孵育（通常16-48小时）。如果T细胞能识别该抗原，就会被激活并分泌细胞因子。

3. 细胞因子捕获：分泌的细胞因子立即被板底包被的抗体捕获在细胞周围。

4. 检测：洗去细胞后，加入生物素化的检测抗体，随后加入酶标记的链霉亲和素。

5. 显色：加入底物，在酶的作用下，在细胞因子被捕获的位置产生不溶性的有色斑点。

6. 计数：每个斑点代表一个曾分泌该细胞因子的抗原特异性T细胞，通过ELISpot读板机或显微镜对斑点进行计数。

实验步骤概要（以IFN-γ ELISpot检测病毒抗原特异性T细胞为例）

第一阶段：实验前准备

1. 试剂与材料：

• 商业化的IFN-γ ELISpot试剂盒（通常包含包被好的板子或包被抗体、检测抗体、酶联物、底物等）

• RPMI-1640完全培养基（含10% FBS, 1% 青霉素-链霉素，L-谷氨酰胺）

• 待测抗原：例如病毒肽段库（peptide pools）、重组蛋白、阳性对照（如PHA或PMA/Ionomycin）、阴性对照（完全培养基或无刺激剂）

• PBMC样本（新鲜分离或液氮冻存后复苏的）

• 无菌PBS、胎牛血清（FBS）、T细胞培养用添加剂等

2. PBMC的准备：

• 新鲜分离：使用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离PBMC。

• 冻存细胞复苏：从液氮中迅速取出冻存的PBMC，在37°C水浴中复苏，用预温的完全培养基洗涤两次，重悬并计数。

• 调整细胞浓度至 1-4 x 10⁶ cells/mL（最终每孔通常接种2-20万个细胞，需预实验优化）。

第二阶段：ELISpot操作流程

1. 板子预处理：

• 如果使用预包被板，直接进行下一步。

• 如果自行包被，用抗人IFN-γ包被抗体4°C过夜包被板子，然后用PBS洗板3次，再加入含10% FBS的培养基在37°C封闭至少1小时。

2. 配制刺激物：

• 用完全培养基将抗原（如肽段库）稀释到所需工作浓度（通常终浓度为1-10 μg/mL/肽段，需优化）。

• 配制阳性对照（PHA通常1-5 μg/mL）和阴性对照（完全培养基）。

3. 加样与刺激：

• 实验孔：抗原

• 阳性对照孔：有丝分裂原（PHA等）

• 阴性对照孔：完全培养基

• 吸弃板中的封闭液。

• 按实验设计向孔中加入刺激物（每孔50-100 μL）：

• 向各孔中加入准备好的PBMC细胞悬液（每孔50-100 μL）。注意：设置复孔（至少3个）以减少误差。

• 轻轻晃动板子混匀，放入37°C，5% CO₂培养箱中孵育 16-24小时（孵育时间需优化）。

4. 孵育后洗涤与检测：

• 小心吸弃细胞和培养液。

• 用预冷的去离子水或PBS洗板4-6次，以彻底去除细胞。最后一次可在扣干在吸水纸上用力扣干。

• 加入生物素化的检测抗体（按试剂盒说明稀释），室温孵育1-2小时。

• 洗板4-6次。

• 加入酶联 Streptavidin（如HRP-Streptavidin），室温孵育1小时。

• 洗板4-6次。

5. 显色：

• 加入新鲜配制的底物溶液（如AEC或BCIP/NBT）。

• 在室温避光条件下显色，直至斑点清晰可见（通常5-30分钟）。

• 当斑点发育良好时，用去离子水冲洗板子终止反应。

• 将板子倒置，在通风处自然晾干。

6. 斑点计数与分析：

• 使用Bioreader的ELISpot读板机进行扫描和计数。

数据分析与结果解读

1. 质控标准：

• 阳性对照孔：必须有大量、清晰的斑点，否则说明实验系统或细胞活性有问题。

• 阴性对照孔：背景应该非常干净，斑点很少（通常<10个斑点/孔）。高背景意味着非特异性结合严重。

2. 结果计算：

• 计算抗原孔和阴性对照孔的平均斑点形成细胞数（SFCs/10⁶ PBMC）。

• 抗原特异性反应 = (抗原刺激孔平均SFC) - (阴性对照孔平均SFC)

• 通常认为，当 (抗原孔SFC) > 2倍 (阴性对照孔SFC) 且 (抗原孔SFC - 阴性对照孔SFC) > 10-20 SFC/10⁶ PBMC 时，可判定为阳性反应。

3. 表示方法：

• 结果通常以 每百万个PBMC中抗原特异性的斑点形成细胞数（SFC/10⁶ PBMC） 来表示。