ELISPOT技术在结核病（Tuberculosis, TB）诊断中的应用

ELISPOT（酶联免疫斑点技术，Enzyme-Linked Immunospot Assay）是一种高度灵敏的免疫学检测技术，用于检测和量化分泌特定细胞因子（如IFN-γ）的单个T细胞。在结核病领域，它被开发为结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB），是γ-干扰素释放试验（IGRA） 的一种。

一、ELISPOT用于TB诊断的基本原理

其核心原理是检测人体免疫系统对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）特异性抗原的反应。

1. 样本采集：从患者外周血中分离出外周血单核细胞（PBMCs），这些细胞中包含T淋巴细胞。

2. 刺激培养：将PBMCs分别与以下物质在包被了抗IFN-γ抗体的微孔板中共同孵育：

• ESAT-6 和 CFP-10：这是两种关键的MTB特异性抗原。它们存在于结核分枝杆菌复合群（包括MTB、牛分枝杆菌等）中，但不存在于绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG） 中。这是IGRA技术区别于传统结核菌素皮试（TST）的关键优势。

• 阳性对照（如植物血凝素PHA）：用于确认细胞具有正常的反应能力。

• 阴性对照（培养基）：用于排除非特异性背景反应。

3. 细胞因子捕获与显色：如果体内存在致敏的T细胞（即曾经感染过MTB），在遇到ESAT-6或CFP-10后，会被激活并大量分泌IFN-γ。IFN-γ立即被板底预包被的抗体所捕获。洗去细胞后，加入酶标记的二抗和底物进行显色反应。

4. 结果判读：在每个被激活的T细胞所在的位置，会形成一个不溶性的彩色斑点（Spot）。一个斑点代表一个对MTB抗原发生反应的T细胞。通过Bioreader 7000计数斑点的数量，即可对反应强度进行量化。

二、ELISPOT (T-SPOT.TB) 的优势

与传统的结核菌素皮试（TST）相比，ELISPOT具有显著优点：

1. 高特异性：由于使用的抗原ESAT-6和CFP-10不在BCG和大多数环境分枝杆菌中存在，因此接种过BCG的人不会出现假阳性结果。这大大提高了诊断的特异性。

2. 高灵敏度：特别适用于免疫抑制人群（如HIV感染者）的结核感染筛查，其灵敏度通常高于TST。

3. 客观量化：结果是数字化的斑点计数，客观性强，避免了TST结果判读的主观性。

4. 快速便捷：整个过程在体外进行，仅需一次抽血，24-48小时内即可获得结果。患者无需再次回访。

5. 区分潜伏性感染与活动性结核：虽然不能完全区分，但通常活动性结核病患者的斑点计数会显著高于潜伏性感染（LTBI）者，但仍需结合临床症状和其他检查综合判断。

三、在TB诊断中的应用场景

1. 潜伏性结核感染（LTBI）的诊断和筛查：这是ELISPOT最主要的应用。用于筛查结核病高危人群，如HIV感染者、器官移植前患者、准备接受抗TNF-α治疗的患者等，以便进行预防性治疗。

2. 活动性结核病的辅助诊断：

• 对于菌阴肺结核、肺外结核（如结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、淋巴结结核等）等难以通过病原学确诊的病例，ELISPOT提供重要的辅助诊断依据。

• 注意：ELISPOT阳性不能区分是LTBI还是活动性结核，必须结合患者的临床表现、影像学、病原学等结果综合判断。

3. 排除结核病：在低流行区，ELISPOT阴性结果对于排除结核感染具有很高的价值。

四、局限性及注意事项

1. 不能区分潜伏感染与活动性结核：这是所有IGRA技术的共同局限。阳性结果只表明感染了MTB，但不能确定是潜伏状态还是活动状态。

2. 成本高昂：检测所需的试剂和设备昂贵，操作技术要求高，限制了其在资源匮乏地区的应用。

3. 操作复杂：需要无菌分离PBMCs，流程步骤多，对实验室条件有要求。

4. 存在假阴性和假阳性的可能：

• 假阴性：见于极度免疫抑制的患者（如CD4计数极低的AIDS患者）、淋巴细胞数量显著减少、操作失误（如细胞活力不足）等。

• 假阳性：极少数非结核分枝杆菌（如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌等）也含有ESAT-6或CFP-10基因，可能导致交叉反应。

5. 不确定结果：有时阴性对照孔斑点过多或阳性对照孔无反应，会导致结果无法判读，需要重新抽血检测。

五、实验流程简要总结

1. 抽血：采集患者外周静脉血于肝素钠抗凝管中。

2. 分离PBMCs：使用密度梯度离心法（如Ficoll）分离PBMCs。

3. 计数与调整浓度：对PBMCs进行计数，并将其浓度调整到标准要求。

4. 加样与刺激：将细胞悬液加入预先包被好抗体的孔板中，并分别加入刺激物（抗原A、抗原B、阳性对照、阴性对照）。

5. 孵育：在37°C，5% CO₂培养箱中孵育16-20小时。

6. 显色：洗去细胞后，依次加入生物素化检测抗体、酶标记链霉亲和素、底物溶液进行显色。

7. 计数与分析：反应终止后，使用自动ELISPOT读板机Bioreader 7000计数斑点，并根据试剂盒提供的算法判定结果（阳性、阴性或不确定）。

结论

ELISPOT技术（以T-SPOT.TB为代表）是结核病诊断领域的一项重要进步。它以其高特异性和高灵敏度，成为了筛查潜伏性结核感染和辅助诊断活动性结核病，特别是对于免疫抑制人群和难以确诊的肺外结核的宝贵工具。然而，临床医生必须理解其局限性，始终将其作为综合诊断策略的一部分，而非唯一的诊断依据。