ELISPOT技术在过敏性疾病研究中的应用

ELISPOT（酶联免疫斑点检测法）是一种高度灵敏的、用于检测和量化单个细胞分泌特定细胞因子（如细胞因子、抗体）功能的免疫学技术。

在过敏性疾病的研究中，它发挥着至关重要的作用，因为它能够揭示免疫系统最核心的效应细胞——T细胞和B细胞——对过敏原的特异性反应。

在过敏性疾病研究中的具体应用

过敏本质上是Th2型免疫反应过度主导的疾病，涉及特定的细胞因子（如IL-4, IL-5, IL-13）和抗体（如IgE）。ELISPOT非常适合研究这些关键分子。

1. 评估过敏原特异性T细胞反应

这是ELISPOT在过敏研究中最核心的应用。通过使用纯化的过敏原（如花生蛋白、桦树花粉、尘螨提取物等）刺激患者的PBMCs，可以精确了解T细胞对过敏原的反应情况。

Th1/Th2平衡分析：

Th2反应： 过敏患者通常会对过敏原产生强烈的Th2反应。ELISPOT可以检测分泌IL-4, IL-5, IL-13的细胞数量。这些斑点的数量与疾病的严重程度和过敏原的特异性密切相关。

Th1反应： 同时，可以检测IFN-γ（Th1特征性细胞因子）的分泌。健康的免疫反应或某些免疫治疗（如脱敏治疗）的目标之一就是促使免疫应答从Th2向Th1偏移。

ELISPOT可以精确量化这种偏移。

调节性T细胞（Treg）功能研究： 可以检测分泌IL-10 或 TGF-β 的细胞。这些细胞对于维持免疫耐受至关重要。评估过敏患者Treg细胞的功能和数量，

有助于理解免疫耐受打破的机制。

2. 监测过敏原特异性免疫治疗（AIT）的疗效和机制

过敏原特异性免疫治疗（脱敏治疗）是目前唯一可能改变过敏性疾病自然进程的方法。ELISPOT是评估其免疫学效应的强大工具。

治疗前/后对比： 在治疗前后采集患者血液，用ELISPOT分析细胞因子分泌谱的变化。

疗效指标： 成功的AIT通常伴随着分泌IL-4、IL-5的Th2细胞减少，而分泌IL-10的Treg细胞和分泌IFN-γ的Th1细胞增加。ELISPOT可以客观地量化这些变化，

作为治疗有效的生物标志物。

阐明机制： 帮助科学家理解AIT是如何诱导免疫耐受的，是通过诱导了Treg还是通过免疫偏离（Th2向Th1转变）。

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3. 检测过敏原特异性B细胞和抗体分泌

虽然较少见，但ELISPOT也可以用于检测分泌过敏原特异性抗体（尤其是IgE）的B细胞。

直接检测IgE-SEC（IgE分泌细胞）： 这对于研究在过敏急性期或暴露后，体内产生IgE的B细胞/浆细胞的频率非常有用。但由于血清中IgE本底水平高且分泌IgE的细胞非常稀少，

技术挑战较大。

检测IgG分泌细胞： 在免疫治疗过程中，会产生阻断性IgG抗体（特别是IgG4）。ELISPOT可以检测分泌过敏原特异性IgG4的B细胞，这些细胞与临床耐受性的建立相关。

4. 发现和鉴定新的过敏原

当研究一种新的过敏原时（例如某种新型食物或不明原因的过敏），ELISPOT可以帮助确定该物质是否含有能激活患者T细胞的蛋白质成分，从而确认其致敏性。

5. 疾病生物标志物研究

ELISPOT检测到的斑点形成细胞（SFU，斑点形成单位）的频率可以作为衡量个体对特定过敏原敏感程度的细胞水平生物标志物。与传统的皮试或sIgE检测相比，它更直接地反

映了细胞免疫状态。

ELISPOT技术的优势

高灵敏度： 能从百万个细胞中检测出单个抗原特异性的细胞。

功能性检测： 检测的是细胞的实际分泌功能，而不仅仅是表面标记或mRNA表达。

单细胞水平： 提供的是频率信息（每百万个细胞中有多少个反应细胞），而不是细胞因子的总浓度。

所需细胞量少： 通常只需少量外周血即可分离出足够的PBMCs进行检测，特别适合儿童临床研究。

挑战与局限性

技术操作要求高： 细胞活性和实验操作技术对结果影响很大。

不能区分细胞亚型： ELISPOT只知道有细胞分泌了细胞因子，但不知道是CD4+ T、CD8+ T还是其他细胞。通常需要与细胞分选技术结合使用。

总结

ELISPOT技术为过敏性疾病研究提供了一个强大而精确的窗口，使研究人员能够：

深入剖析过敏原特异性T细胞反应的极化类型（Th1/Th2/Treg）。

客观评估免疫治疗（如脱敏治疗）引起的免疫学变化。

探寻与临床状态相关的细胞水平生物标志物。

尽管存在一些挑战，但它仍然是理解过敏机制、开发新疗法和评估疗效不可或缺的关键技术之一。