ELISPOT技术在RFFIT（快速荧光灶抑制试验）中的应用

这是一个非常前沿和交叉性的领域，因为它结合了经典的病毒中和抗体检测技术（RFFIT）和先进的细胞免疫反应检测技术（ELISPOT）。

简单来说，ELISPOT技术本身并不直接“应用于”RFFIT检测流程中，而是作为一种强大的补充工具，用于研究与RFFIT结果相关的细胞免疫机制，特别是B细胞反应。

下面我们从几个方面来详细解释：

1. 首先，理解RFFIT和ELISPOT各自是什么

RFFIT (Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test) - 快速荧光灶抑制试验

目的： 检测血清中中和抗体的水平，特别是针对狂犬病病毒的中和抗体。

原理： 将患者血清系列稀释后与固定量的活狂犬病病毒混合。然后将混合物接种到对狂犬病病毒敏感的细胞（如BSR细胞）中。如果血清中含有中和抗体，它们会与病毒结合，

阻止病毒进入细胞并进行复制。最后，用荧光标记的抗体去染色被病毒感染的细胞。通过计数发光的荧光灶数量，可以计算出血清抑制50%病毒感染的稀释度（即中和抗体滴度）。

这是评估狂犬病疫苗免疫效果和暴露后预防是否成功的金标准方法之一。

ELISPOT (Enzyme-Linked Immunospot Assay) - 酶联免疫斑点技术

目的： 检测和量化能够分泌特定细胞因子（如IFN-γ, IL-4）或抗体的免疫细胞（如T细胞、B细胞）的频率。

原理： 在微孔板底部包被捕获抗体。然后加入待测的细胞（如外周血单核细胞PBMCs）和特定的刺激物（如抗原、多肽）。如果细胞被激活并分泌目标分子（如细胞因子），

这些分子会立即被板底的捕获抗体抓住。洗去细胞后，加入生物素化的检测抗体和酶标链霉亲和素，最后加入底物显色。在每个分泌细胞的局部位置会形成一个不溶的斑点，

通过计数斑点数量即可知道分泌该分子的活性细胞的数量。

2. ELISPOT如何与RFFIT研究相关联？

虽然RFFIT提供了至关重要的体液免疫（中和抗体）的终点数据，但它无法告诉我们产生这些抗体的细胞免疫过程。ELISPOT技术正是在这个层面提供了强大的补充信息。

主要应用方向包括：

1. 评估B细胞反应（抗体分泌细胞 - ASCs）

这是最直接的应用。研究人员可以设计狂犬病病毒特异性IgG ELISPOT或抗体分泌细胞（ASC）ELISPOT。

方法： 从接种了狂犬病疫苗的人或动物体内分离出PBMCs，直接在ELISPOT板中用狂犬病病毒抗原（如灭活的全病毒、糖蛋白等）进行刺激。

检测目标： 检测能够分泌狂犬病病毒特异性抗体的记忆B细胞或浆母细胞的数量和频率。

与RFFIT的关系： 通过比较不同个体或不同时间点（如免疫前、免疫后）的ELISPOT斑点形成单位（SFU）和RFFIT中和抗体滴度，可以：

揭示相关性： 研究特异性B细胞反应强度与最终产生的中和抗体水平之间的定量关系。

评估免疫记忆： RFFIT测量的是循环中的抗体，而ELISPOT可以检测出即使循环抗体水平已经下降，但体内是否还存在能够被快速激活的记忆B细胞。这对于评估长期保护力至关重要。

研究早期免疫反应： 在疫苗接种后不久（如第7天），中和抗体可能还未达到可检测水平，但ELISPOT可能已经检测到活化的B细胞开始增殖和分泌抗体，提供了更早的免疫应答指标。

2. 评估T细胞辅助反应（特别是滤泡辅助T细胞 - Tfh）

产生高效价的中和抗体严重依赖于CD4+ T细胞，特别是滤泡辅助T细胞（Tfh）的帮助。Tfh细胞通过分泌细胞因子（如IL-21, IL-4）来促进B细胞的活化、类别转换和亲和力成熟。

方法： 使用IFN-γ或IL-21 ELISPOT等技术。

检测目标： 检测能够识别狂犬病病毒抗原并分泌关键辅助性细胞因子的T细胞频率。

与RFFIT的关系： 强大的Tfh细胞反应通常与更强、更持久的中和抗体反应相关。通过ELISPOT检测T细胞反应，可以帮助解释为什么某些个体（如老年人、免疫低下者）的RFFIT

抗体反应较弱，可能是由于T细胞辅助功能不足。

3. 应用场景与优势

疫苗研发与评价：

比较不同疫苗平台（如mRNA疫苗、灭活疫苗、病毒载体疫苗）诱导的细胞和体液免疫反应的质量（而不仅仅是抗体滴度）。

寻找与强大且持久的中和抗体反应相关的免疫生物标志物（如特定的T细胞或B细胞反应特征）。

临床研究：

研究对疫苗无应答或低应答的个体，其免疫缺陷究竟发生在B细胞层面还是T细胞层面。

监测接受狂犬病暴露后预防（PEP）患者的免疫反应动态。

基础免疫学研究：

深入探究狂犬病病毒感染或疫苗接种后，人体免疫系统被激活的详细机制和时序。

总结

特性 RFFIT ELISPOT (在狂犬病研究中的应用)

检测目标 体液免疫：血清中的中和抗体（功能活性） 细胞免疫：分泌特异性抗体/细胞因子的细胞频率

提供信息 保护效果的终点指标（能否中和病毒） 免疫反应的机制和过程**（如何产生抗体）

关系 互补而非替代。ELISPOT解释了RFFIT结果背后的细胞基础。

优势 功能性强，是保护力的金标准 灵敏度高，可检测低频细胞，提供机制性见解

因此，将ELISPOT技术与RFFIT结合使用，可以提供一份关于狂犬病免疫保护的全景图：既知道了“有没有”足够的保护性抗体（RFFIT），也知道了“为什么有”或“为什么没有”，

即其背后的B细胞和T细胞免疫机制（ELISPOT）。这对于疫苗学研究和临床评估具有极其重要的价值。

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