结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染实验

  结核杆菌感染实验是一个多层次、多学科交叉的复杂领域，涉及基础研究、药物研发、疫苗评估和诊断技术开发等多个方面。实验必须在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行，

因为结核杆菌是强致病性病原体，可通过气溶胶传播。

  今天，我们来看下使用ELISpot法进行结核杆菌感染实验的原理、流程、结果解读及其重要意义。

  ELISpot是用于检测特异性细胞免疫反应（尤其是T细胞反应）的极其灵敏的技术，在结核病研究和诊断中扮演着核心角色。

一、实验原理

  ELISpot（酶联免疫斑点法）的核心原理是：在单细胞水平上，检测并计数能够分泌特定细胞因子的T细胞。

  当人体感染结核杆菌后，致敏的T淋巴细胞（主要是CD4+ Th1细胞，有时也包括CD8+ T细胞和γδ T细胞）在再次遇到结核杆菌特异性抗原时，会被迅速激活并大量分泌细胞因子，

如γ-干扰素。

  ELISpot实验正是捕获这一过程：

  包被：在微孔板底部预包被抗特定细胞因子（如IFN-γ）的捕获抗体。

  孵育与刺激：将待测的外周血单核细胞（PBMCs）与结核杆菌特异性抗原共同加入孔中孵育。

  分泌与捕获：如果存在针对结核杆菌的特异性T细胞，它就会被抗原激活，并在其所在位置分泌IFN-γ。这些IFN-γ会被孔板底部紧邻的捕获抗体立即捕获。

  显色：洗去细胞和未结合的分子后，加入生物素化的检测抗体和酶标链霉亲和素，最后加入底物进行显色反应。

  斑点形成与计数：在每个分泌IFN-γ的T细胞所在的位置，会形成一个不溶性的有色斑点。一个斑点就代表一个被抗原激活的、能分泌该细胞因子的抗原特异性T细胞。

通过Bioreader自动化ELISpot读数仪（酶联免疫斑点读数仪）对斑点进行计数。

二、实验流程（以检测IFN-γ为例）

  样本准备：

    采集疑似感染者或实验对象的外周静脉血。

    通过密度梯度离心法（常用Ficoll分离液）分离出外周血单核细胞。

  抗原选择（关键步骤）：

    ESAT-6 & CFP-10：这是目前最核心、最特异的抗原。它们位于结核杆菌的RD1基因组区域，在卡介苗（BCG）和大部分环境分枝杆菌中缺失。因此，使用它们可以有效

区分结核感染与BCG接种或非结核分枝杆菌感染。

    PPD：旧结核菌素纯蛋白衍生物。它是包含多种抗原的混合物，但特异性较差。BCG接种者和非结核分枝杆菌感染者也可能对PPD产生阳性反应，因此现已逐渐被ESAT-6/

CFP-10所取代。

  实验设置：

    实验孔： PBMCs + 结核特异性抗原（如ESAT-6/CFP-10肽段库）。

    阳性对照孔： PBMCs + 非特异性有丝分裂原（如植物血凝素PHA）。用于确认细胞具有正常的活性和应答能力。如果此孔无反应，则实验无效。

    阴性对照孔： PBMCs + 不含抗原的培养基。用于评估本底水平（背景噪音）。

  孵育与刺激：

    将细胞与抗原在37°C，5% CO₂培养箱中共同孵育16-24小时。这个时间足够让T细胞被激活并分泌细胞因子，但又短到足以防止细胞因子扩散，从而形成清晰的斑点。

  免疫检测与显色：

    孵育结束后，移去细胞，洗板。

    依次加入生物素化的抗IFN-γ抗体、酶标链霉亲和素、显色底物。

    每一步之间都需要充分洗涤。

  斑点计数与分析：

    待斑点清晰后，终止反应，晾干板子。

    使用Bioreader自动化ELISpot分析仪（酶联免疫斑点分析仪）读取并计数每个孔中的斑点形成细胞数。

三、结果解读

  阳性结果： 实验孔的斑点数显著多于阴性对照孔。通常，判定标准为：

  实验孔斑点数 - 阴性对照孔斑点数 ≥ 一定阈值（例如，≥6个斑点/百万细胞，具体阈值因试剂盒而异）。

  并且，（实验孔斑点数） / （阴性对照孔斑点数） ≥ 2或更高。

  满足以上条件，即可判定为阳性，提示体内存在针对结核杆菌的特异性T细胞免疫应答，即存在结核感染（潜伏性或活动性）。

  阴性结果： 实验孔与阴性对照孔的斑点数无显著差异，且阳性对照孔反应正常。提示可能未感染结核。

  不确定结果： 阳性对照无反应（说明细胞状态差，实验失败）或阴性对照本底过高（可能由于非特异性激活或操作污染）。

四、在结核病研究与应用中的意义（IGRA）

  基于ELISpot原理的商业化试剂盒（如T-SPOT.TB）是γ-干扰素释放试验的主要技术形式之一。

  主要优势：

    高灵敏度与特异性： 使用ESAT-6和CFP-10作为抗原，特异性远高于传统的结核菌素皮试（TST），不受BCG接种的干扰。

    快速： 仅需24-48小时即可出结果。

    定量： 可以相对定量体内特异性T细胞的数量。

    高通量： 可同时检测大量样本。

  局限性：

    无法区分潜伏性感染与活动性结核病： ELISpot阳性只能说明存在感染，但不能确定是潜伏还是活动状态，需结合临床症状、影像学和其他微生物学检查进行综合判断。

    成本较高： 需要实验室设备和技术人员。

    操作要求高： 细胞活性的保持至关重要，从采血到分离PBMCs的过程需要在规定时间内完成（通常8小时内）。

总结

  在结核杆菌感染实验中，ELISpot法是一种强大的体外免疫学检测工具。它通过计数分泌IFN-γ的特异性T细胞，来准确判断机体是否对结核杆菌产生了细胞免疫应答，

是诊断潜伏性结核感染和辅助诊断活动性结核的重要方法，尤其在区分BCG接种影响方面具有不可替代的优势。