PBMC ELISpot（以IFN-γ为例）实验方案-参考

斑点法（ELISpot） 是一种高度灵敏的免疫学技术，用于检测和量化分泌特定细胞因子（如IFN-γ, IL-2, IL-4等）的单个细胞。其原理与ELISA类似，但是在PVDF或硝酸纤维素膜板上进行，捕获的抗体在细胞周围形成不溶性的斑点，每一个斑点代表一个抗原特异性的细胞因子分泌细胞。

一、 实验前准备

   试剂与材料：

      ELISpot板：预包被抗人IFN-γ抗体的96孔板（商业试剂盒）。

      分离好的PBMC：从肝素钠或EDTA抗凝外周血中通过密度梯度离心法（如Ficoll）分离得到。

      细胞培养基：RPMI-1640，含10% FBS（热灭活），1% L-谷氨酰胺，1% 青霉素-链霉素（双抗）。

   刺激物：

      阳性对照：植物血凝素（PHA，常用终浓度5-10 μg/mL）或佛波酯（PMA）/离子霉素（Ionomycin）混合物。

      抗原刺激：重叠肽库（如来自CMV, EBV病毒或特定抗原的肽段），或特定蛋白质抗原。常用终浓度1-10 μg/mL。

      阴性对照：仅含完全培养基（无任何刺激物）。

      检测抗体：生物素标记的抗人IFN-γ检测抗体（通常试剂盒内提供）。

      酶标亲和素：辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的链霉亲和素（通常试剂盒内提供）。

      底物溶液：相应的显色底物（如HRP用AEC或TMB，AP用BCIP/NBT）。

      洗涤缓冲液：PBS（pH 7.4）或 PBS + 0.05% Tween-20。

      封闭液：含10% FBS的RPMI-1640培养基或试剂盒指定的封闭液。

   仪器准备：

      生物安全柜用70%乙醇擦拭消毒，提前开启紫外灯灭菌30分钟。

      水浴锅预热至37℃，用于融化FBS和培养基。

      CO₂培养箱设置为37℃，5% CO₂。

      Bioreader 7000 ELISpot斑点读板仪

二、 实验步骤

   第一天：板子准备与细胞铺板

   板子预处理（如需要）：

      对于某些预包被板，使用前需在无菌条件下加入150-200 μL PBS或无菌去离子水预湿膜孔，室温孵育10分钟。（注意：务必根据所用试剂盒的说明书进行操作）

      用无菌移液器彻底吸弃孔内液体。

   封闭：

      每孔加入200 μL 预冷的封闭液（含10% FBS的培养基）。

      盖上板盖，37℃孵育至少30分钟至2小时。

      孵育结束后，在无菌条件下彻底吸弃孔内封闭液。勿洗。

   准备细胞悬液：

      计数PBMC，调整细胞浓度至2-4 × 10⁶ cells/mL（最终每孔铺入20-40万个细胞）。

      根据实验设计，将细胞与不同刺激物在离心管中混合。

      实验组：PBMC + 抗原肽库/蛋白

      阳性对照组：PBMC + PHA

      阴性对照组：PBMC + 完全培养基

   铺板与刺激：

      将步骤3中准备好的细胞-刺激物混合物加入ELISpot板的孔中，每孔100 μL（即每孔含20-40万 cells）。

      轻轻前后左右晃动板子，使细胞均匀分布，切勿涡旋或吹打。

      盖上板盖，放入37℃，5% CO₂培养箱中孵育16-24小时。孵育时间取决于细胞因子和刺激强度。

   第二天：细胞孵育与显色

   去除细胞：

      小心吸弃孔内细胞悬液。

      每孔加入200 μL 冰冷的去离子水，冰上孵育10分钟以裂解细胞。（此步骤可选，根据说明书）

      弃去孔内液体，每孔用200 μL PBS洗涤板子，共6次。每次浸泡1-2分钟再弃去，最后一次在吸水纸上拍干。

   加入检测抗体：

      用洗涤缓冲液或抗体稀释液按说明书推荐浓度稀释生物素标记的检测抗体。

      每孔加入100 μL稀释好的检测抗体。

      盖上板盖，室温（20-25℃）孵育2小时，或4℃过夜。

   洗涤：

      弃去孔内液体，如步骤5所述，用洗涤缓冲液洗板6次，最后一次拍干。

   加入酶标亲和素：

      用洗涤缓冲液或稀释液按说明书稀释酶标亲和素（如HRP-链霉亲和素）。

      每孔加入100 μL稀释好的酶标亲和素。

      盖上板盖，室温避光孵育1小时。

   洗涤：

      弃去孔内液体，如步骤5所述，用洗涤缓冲液洗板6次，最后一次拍干。

   显色：

      根据酶的种类，每孔加入100 μL新鲜配制的底物溶液。

      室温避光显色，密切观察斑点形成情况（通常需要5-30分钟）。

      当阴性对照孔背景很低，而阳性对照孔斑点清晰且未过度融合时，立即用去离子水或自来水冲洗各孔2次以终止反应。

      将板子倒扣在吸水纸上拍干。

   干燥与读板：

      取下板架，让板子在通风处完全避光干燥过夜（非常重要，未干透的膜会粘附板盖）。

      完全干燥后，使用Bioreader 7000自动ELISpot斑点读板仪进行扫描和计数。

三、 数据分析

      结果观察： 肉眼可见的深色斑点即为一个抗原特异性的细胞因子分泌细胞。

      斑点计数： 使用读板软件自动计数每个孔的斑点形成单位（SFU）。

   数据计算：

      背景扣除：通常将抗原孔的斑点数减去阴性对照孔的斑点数。

      结果表示：常用 SFU/10⁶ PBMCs 或 SFU/well 表示。

      阳性判断标准：通常满足以下两点之一可判为阳性：

      实验孔SFU > 阴性对照孔SFU的均值 + 3×标准差。

      实验孔SFU > 阴性对照孔SFU的2倍（且绝对值较高）。

   质控要求：

      阴性对照：应仅有少量或无斑点（通常<50 SFU/10⁶ cells）。

      阳性对照：应有大量清晰的斑点，证明细胞活性和实验系统正常。

四、 注意事项与技巧

      无菌操作： 细胞培养阶段必须在无菌条件下进行，防止污染。

      细胞活性： PBMC的活性至关重要，分离后应尽快进行实验，且活细胞率应>90%。

      无气泡： 加样时避免产生气泡，气泡会阻碍斑点形成。

      勿干燥： 在洗涤和加样过程中，切勿让膜孔干燥，否则会导致高背景。

      优化实验条件： 细胞数量、抗原浓度、孵育时间都需要进行预实验优化。

      避免边缘效应： 培养时可将板子放在培养箱中间，避免打开频繁开关培养箱门。

      设复孔： 建议每个条件设2-3个复孔，以保证数据的可靠性。

此方案为通用流程，请务必以您所使用的特定商业试剂盒的说明书为准进行细节调整。